quarta-feira, 7 de dezembro de 2011

Segunda Avaliação – Disciplina Genética Molecular - comentada


A seguir comentamos a Segunda Avaliação da Disciplina Genética Molecular realizada em 9 de novembro de 2011


1.       1.  Quando baixamos a temperatura de pareamento de certa reação de PCR, passamos a ver múltiplas bandas como resultado da reação no gel de agarose onde antes só havia uma. Qual a razão mais provável disso?
a)       Pareamento não específico dos primers
b)       Fragmentação do produto de PCR
c)        Digestão parcial do produto de PCR
d)       Digestão completa do produto de PCR
e)       Detecção de produtos estendidos
Comentários: a temperatura usual de pareamento de primers na PCR é 56 oC. Nesta temperatura as condições de estringência, representadas pelo movimento browniano das moléculas induzido pelo calor, impedem que os primers possam se parear em sequências sem alta complementaridade. Quando a temperatura é baixada em 5 a 10 graus, começam a ocorrer pareamentos sem uma complementaridade total, o que favorece o aparecimento de bandas extras (não específicas) na eletroforese, como resultado da reação.

2.        2. Em busca de portadores sãos de uma doença recessiva de expressão tardia  ligada a um gene cópia única no genoma amplificamos um trecho do gene e empregamos uma enzima de restrição que só corta o produto de PCR obtido do alelo mutante deste gene. Entre trinta indivíduos, a metade apresentou uma banda no ensaio, 2 apresentaram 2 bandas e o restante 3 bandas. Em que grupos eles se distribuem, respectivamente?
a)       Portadores sãos, afetados e homozigotos normais
b)       Afetados, portadores sãos e homozigotos normais
c)        Homozigotos normais, portadores sãos e afetados
d)       Portadores são, homozigotos normais e afetados
e)       Homozigotos normais, afetados e portadores sãos
Comentários: Se apenas o alelo mutante, como diz o enunciado, é cortado pela E.R., então os indivíduos afetados apresentarão duas bandas. O alelo normal, não sendo cortado, produz uma banda de peso molecular maior do que as duas bandas vistas como resultado do PCR-RFLP. Assim, o portador são, que tem os dois tipos de alelo, vai apresentar três bandas. Somente o homozigoto normal, com dois alelos que não podem ser cortados, apresentará apenas uma banda como resultado (aquela de maior peso molecular).

3.        3. Ao avaliar um trecho do eletroferograma correspondente ao seqüenciamento de um gene polimórfico numa população, a partir do produto de PCR obtido de DNA extraído de linfócitos periféricos, observo 3 picos com dois traços sobrepostos. O que isso indica?
a)       O primer de seqüenciamento foi mal sintetizado, tendo 3 comprimentos distintos
b)       O gene tem três cópias no genoma
c)        O gene está num cromossoma apresentando triploidia
d)       Há três polimorfismos únicos de base no gene, neste caso
e)       Há formação de fita tripla de DNA neste trecho analisado
Comentários: Primeiramente devemos considerar que não houve erros no processo de seqüenciamento. Assim, os três picos com dois traçados devem representar produtos de extensão de igual comprimento, mas que terminam em duas bases diferentes. Como isso só correu em três posições na sequência, só três classes de tamanho estão afetadas, logo não pode ser um problema do primer, que afetaria todos os picos. Também não há relação com trissomia, porque ela implica na existência de três alelos, não de três bases diferentes num único gene. A fitatripla, além de ser muito rara nos genomas, não afetaria o resultado do seqüenciamento, que é feito com um único primer. Mesmo se o gene tivesse três cópias no genoma, teria que haver três bases diferentes entre as cópias, o que implica na presença de polimorfismos únicos de base.


4.      4.  Porque no seqüenciamento o produto de extensão é o que interessa? Na PCR, ele interfere no resultado? Porque?
Comentários: o seqüenciamento é feito com o uso de um único primer, consequentemente são gerados apenas produtos de extensão. Estes, separados por eletroforese, vão determinar a sequência de bases do trecho abaixo da posição de pareamento do primer. Na PCR sempre são gerados produtos de extensão, a partir do DNA molde original, mas eles acumulam na reação de forma linear (isto é, aumentam de número aritmeticamente, e não exponencialmente), ao contrário dos produtos de amplificacão, que acumulam muito rapidamente. Por isso os produtos de extensão, embora presentes, não interferem na reação.

5.        5. Se construímos uma biblioteca de cDNA com células hepáticas de tatu, podemos encontrar nela genes expressando proteínas que são expressas em outros tecidos? Porque?
Comentários: Temos que partir do princípio que todas as células expressam muitos genes em comum. Por isso, não haverá jamais apenas mRNAs exclusivos de células hepáticas numa extração de RNA de hepatócitos: lá estarão presentes também os mRNA que também são expressos em muitas outras células de diferentes tecidos. Por tanto, a resposta deve ser sim, com a explicação dada acima, acrescida do fato de que a biblioteca de cDNA é feita a partir de mRNA.

6.       6.  Uma sonda de DNA foi empregada para encontrar o gene da cadeia leve da clatrina de baleia numa biblioteca genômica deste cetáceo, construída num plasmídeo de 3500 pb. O gene tem 17.000 pb e seis introns e codifica apenas 248aa. Sabendo que a sonda foi desenhada para o terceiro intron e que com ela conseguimos encontrar 7 clones na triagem da biblioteca, podemos afirmar:
a)       Os clones não devem se sobrepor significativamente
b)       Os exons contíguos aos intron têm que estar representados entre os clones
c)        O contig montado não irá conter todo o gene
d)       A região 3´-UTR deve estar representada, pela forma de construção da biblioteca
e)       A sonda reconheceu mais de uma região do genoma.
Comentários: Considerando que o gene é de um eucarioto e que tem vários exons; considerando que isso implica, na grande maioria dos casos, em grandes introns e pequenos exons; e considerando também que o plasmídeo é pequeno, posso admitir que os clones obtidos serão muito menores que o gene e todos eles com um trecho, pelo menos, alinhado com o intron 3. Então, é certo que não conseguiremos construir todo o gene a partir dos 7 clones. Pode ser que os exons vizinhos ao intron 3 apareçam na montagem dos 7 clones, mas o mais provável é que não (os introns devem ser grandes e a montagem só vai cobrir parte do intron 3 e talvez um exon vizinho, à direita ou à esquerda.

7.        7. Porque o uso de enzimas de restrição não permite clonar trechos de DNA repetido?
Comentários: As enzimas de restrição clivam sítios palindrômicos que estão distribuídos ao acaso no genoma de DNA fita dupla. Portanto, elas podem: a) ter um sítio de reconhecimento num trecho de DNA de sequência repetida, ou b) não ter este sítio. No primeiro caso o trecho será fragmentado em muitos pequenos pedaços iguais que, embora possam ser clonados individualmente, não representam o trecho repedido todo (nã~saberemos seu tamanho, por exemplo). Se o sítio não existir, o fragmento gerado será, via de regra, muito grande e não poderá ser clonado.

8.     8.   Ordene os itens de acordo com sua importância no aumento do genoma de eucariotos em relação a procariotos, e entre os diferentes eucariotos. Escreva aqui sua resposta: ______c-d-a-b_________
a)       Cópias de genes (famílias gênicas)
b)       Presença de pseudogenes
c)        Sequências repetidas
d)       Tamanho de introns

9.       9.  O que indica a relação direta com alto índice de correlação entre número de genes e tamanho de genoma em procariotos?
Comentários: Indica que o tamanho médio dos genes é semelhante nos vários procariotos e que eles não têm regiões intergênicas muito variáveis (com repetições, por exemplo). A presença de introns seria secundária, neste caso, porque genes incluem exons e introns. Mas é claro que procariotos não tem, em geral, introns (só em raros casos).

10.     A figura abaixo representa diagramaticamente dois genes de clatrina, de rato e peixe. Considerando que esta comparação é representativa da maior parte dos genes eucariotos entre vertebrados, o que podemos deduzir desta figura quanto ao número de introns e seu tamanho entre vertebrados?


Comentários: Primeiramente, devemos ter em mente que só podemos comentar o que se pode concluir da figura, não adianta fazer um longo discurso sobre evolução, tamanho de genes, etc. A figura mostra que os introns são muito maiores que os exons nos genes de duas espécies de vertebrados. Marginalmente, ela mostra também que os introns do rato são maiores. Isso é tudo. Extrapolando ao máximo, será talvez possível arriscar que os introns maiores do rato poderiam refletir sua maior complexidade (se acharmos que um mamífero é mais complexo que um peixe, o que tem suas justificativas).

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